Laboratorio: DNA Fingerprint[modifica]

Elettroforesi del DNA digerito con enzimi di restrizione[modifica]

Utilizzare guanti e occhiali per non contaminare e non contaminarsi.
Al primo utilizzo del kit (conservato in congelatore) vanno reidratati:
- I campioni liofilizzati di DNA con 200 microlitri di H₂O sterile (fornita)
- Il Mix di enzimi di restrizione con 750 microlitri di sempre di acqua sterile
Scuotere bene i campioni e attendere almeno 15 minuti prima di utilizzarli.

Queste operazioni vanno fatte solo una volta, da chi apre il kit.

L'intero kit è sufficiente per 7-8 corse elettroforetiche su gel
Per la prova i flaconcini con i DNA e il Mix enzimatico vanno scongelati al momento (basta tenerli in mano strettamente); durante la prova vanno tenuti in bagno ghiacciato; al termine vanno messi in congelatore (non frigorifero)
Attenzione a non sprecare DNA e a non contaminarlo, in quanto sarà usato anche da altri gruppi.

Attenzione:

le tre ore potrebbero non essere sufficienti: arrivare almeno al termine della corsa elettroforetica e poi mettere a colorare per una notte.
la lettura si può fare anche nei giorni successivi estraendo il gel dal colorante, asciugandolo delicatamente, avvolgendolo in pellicola trasparente e conservandolo in frigorifero

Preparare 6 microtubi colorati e dotati di tappo: verde, blu, arancio, viola, rosso, giallo.
Utilizzando la micropipetta BIORAD da 2-20 microlitri con puntale della stessa misura, addizionare 10 microlitri di MIX Enzimatico EcoRI/PstI per ciascuno del 6 microtubi (non occorre cambiare il puntale).
Inserire poi 10 microlitri di DNA come segue (cambiare puntale ogni volta):

Tappare, scuotere i microtubi, centrifugare solo pochi secondi, e incubare per 45' a 37" °C in bagno d'acqua.
Nel frattempo preparare il gel d'agarosio 1%. Per ogni piastra sciogliere 0,5 g di Agarosio in 50 ml di tampone TAE 50X diluito a 1X (1 ml di
tampone 50X + 49 ml di acqua distillata), Mescolare.
Scaldare per 15-20 secondi in microonde alla max potenza, controllando che NON vada in ebollizione (non si devono formare bolie): al termine sarà perfettamente incolore (e molto caldo).
Preparare le piastra coprendo con molta cura e più strati di scotch-carta carta le due estremità.
Inserire il pettine a 8 denti ad una estremità.
Versare i 50 ml di gel (prima lasciarlo raffreddare una decina di minuti nella beuta, non deve essere troppo caldo) nella piastra. Attenzione a non formare bolle.
Far raffreddare e solidificare completamente sotto cappa ventilata o, meglio, in frigorifero.

Trascorsi 45' di incubazione a 37° C del DNA+Mix enzimatico prelevare i microtubi e aggiungere a ciascuno 5 microlitri di tintura colorante (LD, loading dye, serve a colorare e appesantire); attenzione alle contaminazioni, cambiare puntale ogni volta).
Preparare anche un settimo microtubo (trasparente) ponendo 5 microlitri di LD e 10 microlitri di DNA marker: è DNA predigerito dall'enzima di restrizione HINDIII lambda i cui frammenti hanno lunghezza nota espressa in coppie di basi (bp, base pair).
Tappare, scuotere tutti i microtubi e poi centrifugare per alcuni secondi.
Verificare che l'agarosio sia solidificato (15-20minuti, cambia colore virando verso un pallido bianco): rimuovere delicatamente lo scotch carta.
Porre la piastra nella vaschetta elettroforetica avendo cura che il pettine sia dalla parte del polo negativo (nero).
Versare il tampone TAE 1X (fino a coprire completamente il gel 275 ml ottenuti mescolando 269.5 ml (g) d'acqua distillata con 5,5 mL di TAE 50x).
Rimuovere delicatamente il pettine.
Impostare la micropipetta BIORAD 2-20 microlitri sul valore desiderato in microlitri da prelevare, ruotando la ghiera superiore. Pipettare nei pozzetti (*) come segue (inserire la punta nel pozzetto fino in fondo, scaricare la quantità, ritirare la punta e solo dopo rilasciare il pulsante; cambiare puntale ogni volta. Conviene porre un foglio intensamente colorato sotto la vaschetta per una migliore visibilità dei pozzetti):

Chiudere le camere elettroforetiche e attivare l'alimentatore: impostare il voltaggio a 100 Ve (l'amperaggio è automatico) il tempo a 45 minuti.
Verificare che passi corrente (bollicine sugli elettrodi).
Al termine della corsa scollegare l'alimentatore, prelevare con attenzione i gel e deporli in vaschetta (il tampone TAE elettroforetico può essere recuperato e riutilizzato alcune volte)
Tagliare l'angolo del gel più vicino al pozzetto contenente il Marker per poterlo orientare successivamente.
Coprire i gel con il colorante (Fast Blast DNA STAIN) così:

per una colorazione LENTA diluire il Fast Blast DNA Stain 500X a 1X (0,5 ml Fast Blast 500X poi portare a 250 ml finali con acqua distillata) e lasciare agire sul gel 12-18 ore, eventualmente agitando ogni qualche ora;
Per una colorazione VELOCE diluire Il Fast Blast DNA Stain 500X a 100X (25 ml Fast Blast 500X e portare a 125 ml finali con acqua distillata.
1. lasciare agire sul gel per 2 minuti agitando dolcemente.
2. Estrarre i gel e porli in un ampio contenitore: risciacquare con acqua di rubinetto corrente a 40-55°C per 10 secondi.
3. Lasciare riposare in acqua di rubinetto a 40-55°C per 5 minuti (ripetere 2 volte)

(In caso di colorazione LENTA) Il giorno dopo recuperare il gel, asciugarlo e avvolgerlo in pellicola trasparente (può essere conservato in frigorifero a 4° C).

Recuperare il colorante che può essere riutilizzato fino a 7 volte.

Osservare i risultati: quale DNA tra S1, S2, S3, S4 e S5 ha le bande uguali a quello del CS?