Laboratorio/Appendice 2
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[modifica] Tamponi
In questa pagina sono raccolte le ricette per la preparazione dei tamponi base da usare nella pratica di laboratorio. Le quantità sono intese per la preparazione di 1 litro di soluzione 1x pronta all'uso, eccetto dove viene specificato altrimenti. Per ottenere soluzioni madre più concentrate adatte allo stoccaggio si moltiplicano le quantità o si diminuisce il volume di un fattore 5 o 10 o 20 per rendere difficoltosa la crescita di muffe nel liquido. nelle soluzioni madre conviene aggiungere sodio azide alla concentrazionefinale dello 0.05% p/p eccetto nelle soluzioni destinate all'uso di perossidasi in quanto verrebbero inattivate dal conservante.
Come aqua di diluizione si può scegliere tra acqua distillata, bidistillata o milli-q a seconda dell'utilizzo.
[modifica] PBS
Preparazione del PBS (Phopsphate buffered saline, soluzione salina tamponata con fosfato). Questa soluzione può essere usata per la lavorazione con cellule.
Quantità per 1 litro di soluzione 1x o 20x:
| Conc | 1x | 20 x | |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | 0,137 M | 8,0 g | 160,0 g |
| Cloruro di potassio | 0,0027 m | 0,2 g | 4 g |
| diSodio idrogenofosfato | 0,008 M | 1,15 g | 23,0 g |
| Potassio diidrogenofosfato | 0,00015 M | 0,02g | 0,4 g |
| pH | 7,2-7,4 |
Se necessario si può aggiungere EDTA nella quantità di 0,2 g/l del sale disodico.
[modifica] PBS per lisi cellulare
È una soluzione ipotonica con aggiunta di un tensioattivo come il TritonX-100 o il Nonidet P-40 e di antiproteasi e se si desidera dell'ortovanadato come antifosfatasi. { un tampone di lisi estremamente blando conviene usare un sonicatore, altrimenti il materiale proteico estratto può essere molto poco.
| conc | 1x | 20 x | |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | 0,01 M | 0,585 g | 11,7 g |
| Cloruro di potassio | 0,0002M | 0,015g | 0,3 |
| diSodio idrogenofosfato | 0,008 M | 1,15 g | 23 g |
| Potassio diidrogenofosfato | 0,00015 M | 0,02g | 0,4 |
| EDTA | 0,2g | ||
| pH | 7,2-7,4 |
[modifica] RIPA
Massima concentrazione effettuabile è 5x in cui comunque crescono le muffe anche se tenuto a +4 gradi, prepararne 100ml alla volta.L'SDS e il Desossicolato sono opzionali, sono utili per una estrazione totale delle proteine anche dal nucleo ma possono interferire con l'interazione proteina-proteina.
| conc | 1x 1 L | 5x 100ml | |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | 0,150M | 8,78 g | 4,39 g |
| Nonidet P-40 | 1% v/v | 10 ml | 5ml |
| Sodio desossicolato | 0.1 g/100ml | 1 g | 0,5g |
| SDS | 0,1% | 1g | 0,5g |
| Tris idrocloruro | 50 mM | 6,06g | 3,03g |
| EDTA | 5 mM | 1,86 g | 0,93g |
| pH | 8,0 |
[modifica] Tris buffered saline
| conc | 1x 1 l | 10x 1 l | |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | 0,150M | 8,8 g | 88,0 g |
| Tris base | 50 mM | 6,1 g | 61,0 g |
| EDTA (acido) | 5 mM | 1,5 g | 15,0 g |
| Nonidet P-40 | 1% v/v | 10 ml | (100 ml) |
| pH | 7.4 |
L' EDTA e Np-40 servono se si desidera usare il tampone come lisante cellulare (circa 1 ml per milione di cellule). Può essere aggiunto al posto dell' NP-40 anche il Triton-X o il tween-20. Nella pratica di laboratorio è difficile che serva lisare tante cellule da preparare 1 litro di 10x con np-40, questo può essere aggiunto al tampone base all'occorrenza, anche perché non altera in maniera significativa il pH.
[modifica] Tampone carbonato-citrato
Tampone basico per ELISA o per colonne di purificazione aminolink. La sua preparazione è un po' più complessa degli altri tamponi per la presenza del carbonato che in ambiente acido diventa CO2. Una volta pesate le polveri procedere in questo modo:
- unire in metà del volume finale il Cloruro di sodio con l'acido citrico o il citrato di sodio
- portare approssimativamente a pH 7
- Attenti, dopo pH 6 il tampone provvisorio tende per piccole aggiunte a schizzare a ph molto basici
- Aggiungere in agitazione il carbonato di sodio poco alla volta
- Aggiustare il pH con HCl
- usare HCl poco concentrato e mantenere la sol in agitazione specialmente nella preparazione del 10x
| Conc | 1x | 10 x | |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | 0,137 M | 8,0 g | 80,0 g |
| Acido citrico anidro | 0,010 M | 2,94 g | 29,4 g |
| Carbonato di sodio | 0,010 M | 1,06 g | 10,6 g |
| pH | 8,5-9 |
Consiglio di preparare la soluzione 1x all'occorrenza, 10-15 ml per una piastra da 96 pozzetti, perché nell'arco di un paio di settimane il tampone altera la sua concentrazione di carbonato.
