Laboratorio di biologia/Appendice 2

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Tamponi[modifica]

In questa pagina sono raccolte le ricette per la preparazione dei tamponi base da usare nella pratica di laboratorio. Le quantità sono intese per la preparazione di 1 litro di soluzione 1x pronta all'uso, eccetto dove viene specificato altrimenti. Per ottenere soluzioni madre più concentrate adatte allo stoccaggio si moltiplicano le quantità o si diminuisce il volume di un fattore 5 o 10 o 20 per rendere difficoltosa la crescita di muffe nel liquido. nelle soluzioni madre conviene aggiungere sodio azide alla concentrazionefinale dello 0.05% p/p eccetto nelle soluzioni destinate all'uso di perossidasi in quanto verrebbero inattivate dal conservante.

Come aqua di diluizione si può scegliere tra acqua distillata, bidistillata o milli-q a seconda dell'utilizzo.

PBS[modifica]

Preparazione del PBS (Phopsphate buffered saline, soluzione salina tamponata con fosfato). Questa soluzione può essere usata per la lavorazione con cellule.

Quantità per 1 litro di soluzione 1x o 20x:

Conc 1x 20 x
Cloruro di sodio 0,137 M 8,0 g 160,0 g
Cloruro di potassio 0,0027 M 0,2 g 4 g
diSodio idrogenofosfato 0,008 M 1,15 g 23,0 g
Potassio diidrogenofosfato 0,00015 M 0,02 g 0,4 g
pH 7,2-7,4

Se necessario si può aggiungere EDTA nella quantità di 0,2 g/L del sale disodico.

PBS per lisi cellulare[modifica]

È una soluzione ipotonica con aggiunta di un tensioattivo come il TritonX-100 o il Nonidet P-40 e di antiproteasi e se si desidera dell'ortovanadato come antifosfatasi. { un tampone di lisi estremamente blando conviene usare un sonicatore, altrimenti il materiale proteico estratto può essere molto poco.

conc 1x 20 x
Cloruro di sodio 0,01 M 0,585 g 11,7 g
Cloruro di potassio 0,0002 M 0,015 g 0,3 g
diSodio idrogenofosfato 0,008 M 1,15 g 23 g
Potassio diidrogenofosfato 0,00015 M 0,02g 0,4 g
EDTA 0,2 g
pH 7,2-7,4

RIPA[modifica]

Massima concentrazione preparabile è 5x in cui comunque crescono le muffe anche se tenuto a +4 gradi, prepararne 100 mL alla volta.L'SDS e il Desossicolato sono opzionali, sono utili per una estrazione totale delle proteine anche dal nucleo ma possono interferire con l'interazione proteina-proteina.

conc 1x 1 L 5x 100 mL
Cloruro di sodio 0,150 M 8,78 g 4,39 g
Nonidet P-40 1% v/v 10 mL 5 mL
Sodio desossicolato 0.1 g/100 mL 1 g 0,5 g
SDS 0,1% 1 g 0,5 g
Tris idrocloruro 50 mM 6,06 g 3,03 g
EDTA 5 mM 1,86 g 0,93 g
pH 8,0

Tris buffered saline[modifica]

conc 1x 1 L 10x 1 L
Cloruro di sodio 0,150 M 8,8 g 88,0 g
Tris base 50 mM 6,1 g 61,0 g
EDTA (acido) 5 mM 1,5 g 15,0 g
Nonidet P-40 1% v/v 10 mL (100 mL)
pH 7.4

L' EDTA e Np-40 servono se si desidera usare il tampone come lisante cellulare (circa 1 mL per milione di cellule). Può essere aggiunto al posto dell' NP-40 anche il Triton-X o il Tween-20. Nella pratica di laboratorio è difficile che serva lisare tante cellule da preparare 1 litro di 10x con NP-40, questo può essere aggiunto al tampone base all'occorrenza, perché non altera in maniera significativa il pH.

Tampone carbonato-citrato[modifica]

Tampone basico per ELISA o per colonne di purificazione aminolink. La sua preparazione è un po' più complessa degli altri tamponi per la presenza del carbonato che in ambiente acido diventa CO2. Una volta pesate le polveri procedere in questo modo:

  • unire in metà del volume finale il Cloruro di sodio con l'acido citrico o il citrato di sodio
  • portare approssimativamente a pH 7
    • Attenti, dopo pH 6 il tampone provvisorio tende per piccole aggiunte a schizzare a ph molto basici
  • Aggiungere in agitazione il carbonato di sodio poco alla volta
  • Aggiustare il pH con HCl
    • usare HCl poco concentrato e mantenere la sol in agitazione specialmente nella preparazione del 10x
Conc 1x 10 x
Cloruro di sodio 0,137 M 8,0 g 80,0 g
Acido citrico anidro 0,010 M 2,94 g 29,4 g
Carbonato di sodio 0,010 M 1,06 g 10,6 g
pH 8,5-9

Consiglio di preparare la soluzione 1x all'occorrenza, 10-15 mL per una piastra da 96 pozzetti, perché nell'arco di un paio di settimane il tampone altera la sua concentrazione di carbonato.