Laboratorio di biologia/Immunostaining

Wikibooks, manuali e libri di testo liberi.
Jump to navigation Jump to search


Questa tecnica si usa per visualizzare in quali zone della sezione di tessuto si trovano determinati antigeni, per far questo si usano gli anticorpi.


Materiali[modifica]

  • vetrino con una sezione non colorata
  • vetrino coprioggetto
  • un supporto per vetrini con manico lungo almeno 5-10 cm
  • 8 vaschette di vetro la cui dimensione sia compatibile con quella del portavetrini
    • 6 di queste andranno a formare la scala di idratazione/deidratazione e colorazione una per l'ematossilina e un'altra (preferibilmente in pirex) sarà usata per i passaggi di lavoro.
  • Pipettatrice tipo gilson da 200 microlitri
  • xilene, 2 vaschette
  • etanolo assoluto, 2 vaschette
  • etanolo 90°, 2 vaschette
  • Emallume di Mayer (Ematossilina)
  • acqua distillata 2 litri
  • tampone citrato per IIC
  • Soluzione di perossido di idrogeno al 3%
  • PBS tampone fosfato in soluzione salina
  • Siero di cavallo
  • Anticorpo primario
  • Anticorpo secondario coniugato con HRP
  • Soluzione di diamminobenzidina DAB in tampone di reazione
  • Montante per vetrini

Protocollo[modifica]

Idratazione[modifica]

Mettere il vetrino in stufa 60 °C fino a quando la paraffina non è diventata liquida.

Dopodiché si immerge:

  1. 20 minuti in xilene 1
  2. 15 min in xilene 2
  3. 10 min in etanolo assoluto 1
  4. 10 min etanolo assoluto 2
  5. 5 min in etanolo 90° 1
  6. 5 min in etanolo 90° 2
  7. 20 min i acqua distillata

Smascheramento antigenico[modifica]

Immergere i vetrini in tampone citrato e in tre cicli da 5' in microonde a 700W controllando che il livello dell'acqua copra sempre il vetrino, rabboccando con acqua distillata alla stessa riscaldata in parallelo. Oppure in bagnomaria a 98 °C Una volta finito lasciare raffreddare a temperatura ambiente e lavare 2 volte con acqua distillata.

Inibizione delle perossidasi del campione[modifica]

Mettere a bagno i vetrini con la soluzione di H2O2 per 20 min al buio. Sciacquare con acqua distillata

Anticorpo primario[modifica]

I successivi 3 passaggi vanno effettuati in camera umida.

Lavare con PBS (tampone fosfato) e depositare, dopo aver cerchiato le sezioni con la PAP pen, siero di cavallo diluito 1:100 v/v con PBS. Togliere il liquido con carta assorbnte e depositare uniformemente la soluzione dell'anticorpo primario da lasciare per 1 ora al buio. Lavare 3 volte in PBS.

Anticorpo secondario[modifica]

Cospargere i campioni con una soluzione di anticorpo secondario perossidato e lasciare agire per 20 min al buio. Lavare per tre volte con pbs

Sviluppo[modifica]

Aggiungere la soluzione di DAB (manipolare con cautela, è cancerogeno!) a lasciare 7 min al buio, neutralizzare le rimanenze e le gocce cadute al di fuori del vetrino con ipoclorito di sodio concentrato, che non deve toccare assolutamente i vetrini

Dopodiché sciacquare i vetrini in flusso di acqua di corrente, per 5 min.

Contro colorazione[modifica]

  1. Lavare in acqua distillata per 5 min
  2. Passare, agitando, i vetrini nella soluzione di ematossilina per al massimo 20 sec.
  3. sciacquare in acqua distillata agitando delicatamente
  4. virare in acqua di rubinetto per 4 minuti fino a quando il colorante vira da rosso a viola
  5. sciacquare in acqua distillata per 5 min

Disidratazione e montaggio[modifica]

Eseguire al contrario i passaggi di cui al punto primo (idratazione)

Cospargere il vetrino con un poco di montante.

Montare il vetrino coprioggetto e fare asciugare in stufa.

Risultato[modifica]

Er a 1.JPG

Questa e l'mmagine di un carcinoma mammario colorato per il recettore per gli estrogeni. La diamminobenzidina che ha reagito si colora in marrone e quindi le aree marroni della sezione sono quelle dove è presente l'antigene.