Laboratorio di biologia/Elettroforesi

In generale con il termine di elettroforesi si intende la migrazione attraverso un mezzo fluido e sotto l’influenza di un campo elettrico di particelle dotate di cariche elettriche. Più frequentemente si studia con questa tecnica la migrazione delle macromolecole per ottenere la loro separazione qualitativa e la loro analisi quantitativa, in base alla diversa densità di carica superficiale delle varie molecole. In campo biochimico la sua applicazione maggiore risulta essere lo studio di proteine semplici e coniugate.

Le proteine sono degli anfoliti, ovvero polielettroliti capaci ionizzarsi sia positivamente sia negativamente in base al pH del mezzo in cui è disciolta la proteina. Il valore del pH che corrisponde alla neutralità della proteina è definito punto isoelettrico della macromolecola stessa. Immersa in un fluido con pH uguale al suo PI, la proteina sarà elettricamente neutra. Il comportamento elettroforetico di una proteina risulta quindi essere in relazione al rapporti tra il pH del mezzo ed il PI della molecola.

Elettroforesi zonale

Nell’elettroforesi zonale, o su supporto solido, la migrazione e la separazione delle molecole avvengono tra i pori di un supporto solido, il più possibile inerte. Le varie specie molecolari si separano in bande o zone localizzate in posizioni diverse sul supporto. L’elettroforesi zonale presenta notevoli vantaggi:

• necessita di apparecchiature semplici, costituite da vaschette per migrazione elettroforetica corredate di alimentatore e potenziometro
• richiede un volume di materiale molto ridotto (2-50μm)
• consente di separare i componenti della miscela in zone distinte così da poterli rilevare con tecniche analitiche chimiche o fisiche.

Inoltre è anche possibile, dopo la separazione elettroforetica, ricorrere alla combinazione di tecniche particolari come l’immunodiffusione. In generale i supporti devono essere permeabili alle sostanze da separare, inerti e non interferire con i metodi di rivelazione.

Esistono vari tipi di supporto:

• Carta da filtro: il più economico ed il più facilmente reperibile. Viene usata sotto forma di strisce larghe 2-4 cm e lunghe 15-30 cm. È costituita essenzialmente da un intreccio di fibre capillari . Viene utilizzata facendo pescare la striscia da due vaschette con una differenza di potenziale: si assiste ad un flusso d’acqua dall’anodo al catodo. L’esame viene effettuato a pH 8,6, cosicché tutte le proteine sieriche abbiano una carica netta positiva. Un inconveniente dovuto a questo supporto è l’adsorbimento dell’albumina lungo tutto il cammino, fenomeno che comporta una separazione non netta. Inoltre è complesso rendere la cellulosa trasparente per le successive fasi di lettura. Per questi motivi questo supporto è ormai stato abbandonato.

• Acetato di cellulosa: superiore alla semplice cellulosa, in quanto non presenta fenomeni di adsorbimento, ha una elevata porosità che implica migrazione più lenta con formazione di bande più nette e strette, si ha meno diffusione delle bande e la diafanizzazione risulta più agevole.

• Gel di amido: la sua struttura porosa permette di frazionare le molecole non solo dal punto di vista elettrico, ma anche in base al peso molecolare. Esso funge infatti da setaccio, risolvendo le proteine sieriche in oltre 20 frazioni. Viene utilizzato nello studio delle emoglobine.

• Gel di agarosio: questo gel non ha effetto di setaccio molecolare, presenta in misura molto ridotta il fenomeno dell’endoosmosi (migrazione non dovuta a migrazione elettrica) e rende agevoli i processi di colorazione e immunodiffusione. Viene utilizzato maggiormente nelle migrazioni di acidi nucleici.

• Gel di poliacrilammide: la migrazione su questo supporto viene spesso indicata con l’acronimo PAGE. Questi gel vengono definiti in base alla percentuale totale di acrilammide presente: gel a bassa percentuale presentano grossi pori (utilizzati quando la migrazione deve avvenire solo in base alla carica elettrica) mentre a concentrazioni più elevate si hanno pori più piccoli che permettono di separare le molecole anche in base a forze frizionali che le distinguono in base alla loro dimensione.

Per l’identificazione dei componenti sul supporto si possono utilizzare vari metodi quali la fluorescenza, l’assorbimento di luce in UV, l’autoradiografia… Per le proteine sieriche si procede a colorazione utilizzando soluzioni di sostanze coloranti che hanno la proprietà di legarsi ad esse (es. amido di schwarz, verde di bromofenolo). Se si vogliono evidenziare componenti proteiche particolari, si ricorre a coloranti specifici come il nero sudan per le lipoproteine, il PAS per le glicoproteine, la benzidina-H2O2 per i complessi aptoglobina-emoglobina.. Se invece si vuole evidenziare una singola frazione proteica si ricorre alle reazioni Ag/Ab, ottenendo degli archi di precipitazione (evidenziati meglio in seguito a colorazione).

Gli elettroferogrammi (strisce con le bande proteiche colorate) possono venire analizzati per mezzo di tre differenti procedimenti:

• Eluizione dal supporto: consiste nel tagliare il supporto in corrispondenza delle zone di separazione delle diverse frazioni, l’eluizione del complesso proteina-colorante e la successiva analisi spettrofotometrica della soluzione colorata

• Soluzione del supporto: sempre in seguito al ritaglio della zona interessata si scioglie il supporto mediante un solvente adatto (acetone-acido acetico glaciale). Anche in questo caso l’assorbanza della soluzione viene misurata dallo spettrofotometro.

• Lettura diretta tramite scanzione: prima è necessario diafanizzare il più possibile il supporto. In seguito la striscia viene analizzata da un apparecchio, molto simile ad un fotometro, che consente di misurare l’assorbanza delle varie bande colorate: si ottiene così un grafico, detto tracciato elettroforetico, nel quale all’area di ogni singolo picco corrisponde la concentrazione di quella data sostanza. Se si moltiplicano i valori delle percentuali relative di ogni frazione per il contenuto delle proteine totali si ottengono i valori assoluti in peso di ogni componente proteica.

Immunoelettroforesi

È una tecnica che unisce in un procedimento analitico sequenziale il principio dell’elettroforesi zonale con quello dell’immunodiffusione doppia bidimenzionale e per ultima la reazione Ag/Ab. In seguito ad una elettroforesi zonale, nel senso della lunghezza del supporto si fa avvenire una diffusione laterale dell’antisiero a partire da una scanalatura ricavata nel gel parallelamente alla direzione della migrazione. Nelle zone del gel in cui le concentrazioni reciproche sono ottimali, si formano degli archi di precipitazione visibili ad occhio nudo o in seguito a colorazione. Questa metodica viene utilizzata come indagine qualitativa, soprattutto nello studio delle γ-patie monoclonali e nello studio di varianti proteiche.

Gel in gradiente

Si tratta di un gel di poliacrilammide nel quale si ha un gradiente di concentrazione dell’acrilammide stessa. Tale percentuale varia tipicamente da un 5% in superficie fino ad un 25% al fondo del gel. Pertanto, mentre alla sommità del gel sono presenti pori di grossi dimensioni, man mano che si va verso il fondo si avrà una diminuzione delle dimensioni dei pori. In una miscela complessa di proteine si avrà una separazione maggiore rispetto ad un gel convenzionale in quanto la proteina migra fino a raggiungere le dimensioni limite del poro, impaccandosi e producendo una banda molto stretta. Una proteina di peso molecolare poco inferiore sarà in grado di migrare un po’ di più, impaccandosi poco oltre in un’altra banda sottile. Così, invece di avere un’unica banda in cui le due proteine sfumano l’una nell’altra, si ottengono due bande sottili e ben definite.

Rivelazione

Il colorante più utilizzato è il Coomassie Blue, con un potere risolutivo dell’ordine di 0,1 μg. Tuttavia, per avere una maggiore sensibilità si può utilizzare la colorazione ad argento (gli ioni argento vengono ridotti ad argento metallico sulla proteina) arrivando a rivelare quantità dell’ordine di 1 ng. Viene anche utilizzato l’amido nero.

Western blotting

L’elettroforesi su gel di poliacrilammide può essere utilizzata anche come metodica preparatoria per analisi ulteriori. A tale scopo il primo passaggio consiste nel trasferire il pattern elettroforetico su un foglio di nitrocellulosa, effettuabile in due modi:

• per capillarità, ponendo il gel sopra uno spesso strato di carta da filtro imbevuta di tampone e coperto da un altro strato di carta assorbente. Il tutto viene pressato da un peso e tenuto così per una notte. Avviene così il trasferimento del pattern proteico (solo di una piccola parte) dal gel al foglio di nitrocellulosa a cui le proteine si legano irreversibilmente mediante reazioni idrofobiche.

• Per elettroblotting. Il gel e la nitrocellulosa vengono posti tra due elettrodi paralleli e immersi in un tampone. La migrazione avviene molto più velocemente.

Il blot viene poi incubato in una soluzione proteica, in modo da saturare tutti i siti di interazione idrofobica del foglio. In seguito si colora utilizzando anticorpi specifici per la proteina da rilevare. Il principio su cui si basa la rivelazione è analogo a quello applicato nel dosaggio immunoenzimatico.

Applicazioni in cimica clinica Mediante elettroforesi zonale si ottiene la separazione delle proteine sieriche in cinque frazioni: albumina, α1, α2, β e γ globuline, in base alla mobilità elettroforetica decrescente. In alcune variazioni patologiche si possono evidenziare variazioni tipiche, sia in relazione alla quantità di singole frazioni proteiche (come nella sindrome nefrosica, nell’ipoalbuminemia, nell’ipoγglobulinemia) sia in relazione alla qualità di ogni frazione: ciascuna banda infatti, fatta eccezione per l’albumina, è ampiamente disomogenea. Ne consegue che alterazioni patologiche possono dar luogo a profili elettroforetici caratteristici. Tipico è il caso del mieloma, in cui si possono apprezzare picchi monoclonali nella zona delle γ-globuline.

Anche per l’analisi e la determinazione quantitativa delle emoglobine normali e patologiche l’elettroforesi zonale ha trovato ampie applicazioni, ricorrendo al sistema cosiddetto dell’impronta digitale.

Principali componenti delle frazioni sieriche in elettroforesi

• Albumina. Costituisce più della metà delle proteine sieriche. Oltre a trasportare sostanze attraverso la circolazione del sangue, l’albumina è la maggiore responsabile dell’azione oncotica, evitando la perdita eccessiva di fluidi dai capillari. Può anche essere d’aiuto nella crescita tissutale e nei processi di guarigione.
• α1-globulina. Le lipoproteine ad alta densità (HDL), ovvero i trasportatori del “colesterolo buono” fanno parte di questa frazione.
• α2-globulina. L’haptoglobina, una proteina legante l’emoglobina, fa parte di questa frazione.
• β-globulina. Oltre a funzione di trasporto, le β-globuline aiutano i processi immunitari. La proteina C3 del complemento fa infatti parte di questa frazione. Anche la trasferrina, trasportatore del ferro, è inclusa nelle β-globuline.
• γ-globuline. La funzione principale delle proteine che compongono questa banda è la prevenzione e la lotta alle infezioni. Alcune di esse si legano a sostanze estranee (batteri o virus), permettendone la distruzione da parte del sistema immunitario. Le γ-globuline sono anche dette anticorpi.