Biologia per il liceo/Laboratorio: DNA fingerprint
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Laboratorio: DNA Fingerprint
[modifica | modifica sorgente]Elettroforesi del DNA digerito con enzimi di restrizione
[modifica | modifica sorgente]Avvertenze preliminari
[modifica | modifica sorgente]- Utilizzare guanti e occhiali per non contaminare e non contaminarsi.
- Al primo utilizzo del kit (conservato in congelatore) vanno reidratati:
- I campioni liofilizzati di DNA con 200 microlitri di H₂O sterile (fornita)
- Il Mix di enzimi di restrizione con 750 microlitri di sempre di acqua sterile
- Scuotere bene i campioni e attendere almeno 15 minuti prima di utilizzarli.
Queste operazioni vanno fatte solo una volta, da chi apre il kit.
- L'intero kit è sufficiente per 7-8 corse elettroforetiche su gel
- Per la prova i flaconcini con i DNA e il Mix enzimatico vanno scongelati al momento (basta tenerli in mano strettamente); durante la prova vanno tenuti in bagno ghiacciato; al termine vanno messi in congelatore (non frigorifero)
- Attenzione a non sprecare DNA e a non contaminarlo, in quanto sarà usato anche da altri gruppi.
Attenzione:
- le tre ore potrebbero non essere sufficienti: arrivare almeno al termine della corsa elettroforetica e poi mettere a colorare per una notte.
- la lettura si può fare anche nei giorni successivi estraendo il gel dal colorante, asciugandolo delicatamente, avvolgendolo in pellicola trasparente e conservandolo in frigorifero
Protocollo
[modifica | modifica sorgente]- Preparare 6 microtubi colorati e dotati di tappo: verde, blu, arancio, viola, rosso, giallo.
- Utilizzando la micropipetta BIORAD da 2-20 microlitri con puntale della stessa misura, addizionare 10 microlitri di MIX Enzimatico EcoRI/PstI per ciascuno del 6 microtubi (non occorre cambiare il puntale).
- Inserire poi 10 microlitri di DNA come segue (cambiare puntale ogni volta):
- CS (Crime Scene) nel tubo verde
- S1 (Suspected 1) nel tubo blu
- S2 nel tubo arancio
- S3 nel tubo viola
- S4 nel tubo rosso
- S5 nel tubo giallo
- Tappare, scuotere i microtubi, centrifugare solo pochi secondi, e incubare per 45' a 37" °C in bagno d'acqua.
- Nel frattempo preparare il gel d'agarosio 1%. Per ogni piastra sciogliere 0,5 g di Agarosio in 50 ml di tampone TAE 50X diluito a 1X (1 ml di
- tampone 50X + 49 ml di acqua distillata), Mescolare.
- Scaldare per 15-20 secondi in microonde alla max potenza, controllando che NON vada in ebollizione (non si devono formare bolie): al termine sarà perfettamente incolore (e molto caldo).
- Preparare le piastra coprendo con molta cura e più strati di scotch-carta carta le due estremità.
- Inserire il pettine a 8 denti ad una estremità.
- Versare i 50 ml di gel (prima lasciarlo raffreddare una decina di minuti nella beuta, non deve essere troppo caldo) nella piastra. Attenzione a non formare bolle.
- Far raffreddare e solidificare completamente sotto cappa ventilata o, meglio, in frigorifero.
- Trascorsi 45' di incubazione a 37° C del DNA+Mix enzimatico prelevare i microtubi e aggiungere a ciascuno 5 microlitri di tintura colorante (LD, loading dye, serve a colorare e appesantire); attenzione alle contaminazioni, cambiare puntale ogni volta).
- Preparare anche un settimo microtubo (trasparente) ponendo 5 microlitri di LD e 10 microlitri di DNA marker: è DNA predigerito dall'enzima di restrizione HINDIII lambda i cui frammenti hanno lunghezza nota espressa in coppie di basi (bp, base pair).
- Tappare, scuotere tutti i microtubi e poi centrifugare per alcuni secondi.
- Verificare che l'agarosio sia solidificato (15-20minuti, cambia colore virando verso un pallido bianco): rimuovere delicatamente lo scotch carta.
- Porre la piastra nella vaschetta elettroforetica avendo cura che il pettine sia dalla parte del polo negativo (nero).
- Versare il tampone TAE 1X (fino a coprire completamente il gel 275 ml ottenuti mescolando 269.5 ml (g) d'acqua distillata con 5,5 mL di TAE 50x).
- Rimuovere delicatamente il pettine.
- Impostare la micropipetta BIORAD 2-20 microlitri sul valore desiderato in microlitri da prelevare, ruotando la ghiera superiore. Pipettare nei pozzetti (*) come segue (inserire la punta nel pozzetto fino in fondo, scaricare la quantità, ritirare la punta e solo dopo rilasciare il pulsante; cambiare puntale ogni volta. Conviene porre un foglio intensamente colorato sotto la vaschetta per una migliore visibilità dei pozzetti):
- Pozzetto 1: Marker, 10 microlitri
- Pozzetto 2: CS, 20 microlitri
- Pozzetto 3: S1, 20 microlitri
- Pozzetto 4: S2, 20 microlitri
- Pozzetto 5: S3, 20 microlitri
- Pozzetto 6: S4, 20 microlitri
- Pozzetto 7: S5, 20 microlitri
- Chiudere le camere elettroforetiche e attivare l'alimentatore: impostare il voltaggio a 100 Ve (l'amperaggio è automatico) il tempo a 45 minuti.
- Verificare che passi corrente (bollicine sugli elettrodi).
- Al termine della corsa scollegare l'alimentatore, prelevare con attenzione i gel e deporli in vaschetta (il tampone TAE elettroforetico può essere recuperato e riutilizzato alcune volte)
- Tagliare l'angolo del gel più vicino al pozzetto contenente il Marker per poterlo orientare successivamente.
- Coprire i gel con il colorante (Fast Blast DNA STAIN) così:
- per una colorazione LENTA diluire il Fast Blast DNA Stain 500X a 1X (0,5 ml Fast Blast 500X poi portare a 250 ml finali con acqua distillata) e lasciare agire sul gel 12-18 ore, eventualmente agitando ogni qualche ora;
- Per una colorazione VELOCE diluire Il Fast Blast DNA Stain 500X a 100X (25 ml Fast Blast 500X e portare a 125 ml finali con acqua distillata.
- lasciare agire sul gel per 2 minuti agitando dolcemente.
- Estrarre i gel e porli in un ampio contenitore: risciacquare con acqua di rubinetto corrente a 40-55°C per 10 secondi.
- Lasciare riposare in acqua di rubinetto a 40-55°C per 5 minuti (ripetere 2 volte)
- (In caso di colorazione LENTA) Il giorno dopo recuperare il gel, asciugarlo e avvolgerlo in pellicola trasparente (può essere conservato in frigorifero a 4° C).
Recuperare il colorante che può essere riutilizzato fino a 7 volte.
Conclusione
[modifica | modifica sorgente]Osservare i risultati: quale DNA tra S1, S2, S3, S4 e S5 ha le bande uguali a quello del CS?