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Biologia per il liceo/Laboratorio: DNA fingerprint

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Indice del libro

Laboratorio: DNA Fingerprint[modifica]

Elettroforesi del DNA digerito con enzimi di restrizione[modifica]

Avvertenze preliminari[modifica]

  • Utilizzare guanti e occhiali per non contaminare e non contaminarsi.
  • Al primo utilizzo del kit (conservato in congelatore) vanno reidratati:
    • I campioni liofilizzati di DNA con 200 microlitri di H₂O sterile (fornita)
    • Il Mix di enzimi di restrizione con 750 microlitri di sempre di acqua sterile
  • Scuotere bene i campioni e attendere almeno 15 minuti prima di utilizzarli.

Queste operazioni vanno fatte solo una volta, da chi apre il kit.

  • L'intero kit è sufficiente per 7-8 corse elettroforetiche su gel
  • Per la prova i flaconcini con i DNA e il Mix enzimatico vanno scongelati al momento (basta tenerli in mano strettamente); durante la prova vanno tenuti in bagno ghiacciato; al termine vanno messi in congelatore (non frigorifero)
  • Attenzione a non sprecare DNA e a non contaminarlo, in quanto sarà usato anche da altri gruppi.

Attenzione:

  • le tre ore potrebbero non essere sufficienti: arrivare almeno al termine della corsa elettroforetica e poi mettere a colorare per una notte.
  • la lettura si può fare anche nei giorni successivi estraendo il gel dal colorante, asciugandolo delicatamente, avvolgendolo in pellicola trasparente e conservandolo in frigorifero

Protocollo[modifica]

  • Preparare 6 microtubi colorati e dotati di tappo: verde, blu, arancio, viola, rosso, giallo.
  • Utilizzando la micropipetta BIORAD da 2-20 microlitri con puntale della stessa misura, addizionare 10 microlitri di MIX Enzimatico EcoRI/PstI per ciascuno del 6 microtubi (non occorre cambiare il puntale).
  • Inserire poi 10 microlitri di DNA come segue (cambiare puntale ogni volta):
  1. CS (Crime Scene) nel tubo verde
  2. S1 (Suspected 1) nel tubo blu
  3. S2 nel tubo arancio
  4. S3 nel tubo viola
  5. S4 nel tubo rosso
  6. S5 nel tubo giallo
  • Tappare, scuotere i microtubi, centrifugare solo pochi secondi, e incubare per 45' a 37" °C in bagno d'acqua.
  • Nel frattempo preparare il gel d'agarosio 1%. Per ogni piastra sciogliere 0,5 g di Agarosio in 50 ml di tampone TAE 50X diluito a 1X (1 ml di
  • tampone 50X + 49 ml di acqua distillata), Mescolare.
  • Scaldare per 15-20 secondi in microonde alla max potenza, controllando che NON vada in ebollizione (non si devono formare bolie): al termine sarà perfettamente incolore (e molto caldo).
  • Preparare le piastra coprendo con molta cura e più strati di scotch-carta carta le due estremità.
  • Inserire il pettine a 8 denti ad una estremità.
  • Versare i 50 ml di gel (prima lasciarlo raffreddare una decina di minuti nella beuta, non deve essere troppo caldo) nella piastra. Attenzione a non formare bolle.
  • Far raffreddare e solidificare completamente sotto cappa ventilata o, meglio, in frigorifero.
  • Trascorsi 45' di incubazione a 37° C del DNA+Mix enzimatico prelevare i microtubi e aggiungere a ciascuno 5 microlitri di tintura colorante (LD, loading dye, serve a colorare e appesantire); attenzione alle contaminazioni, cambiare puntale ogni volta).
  • Preparare anche un settimo microtubo (trasparente) ponendo 5 microlitri di LD e 10 microlitri di DNA marker: è DNA predigerito dall'enzima di restrizione HINDIII lambda i cui frammenti hanno lunghezza nota espressa in coppie di basi (bp, base pair).
  • Tappare, scuotere tutti i microtubi e poi centrifugare per alcuni secondi.
  • Verificare che l'agarosio sia solidificato (15-20minuti, cambia colore virando verso un pallido bianco): rimuovere delicatamente lo scotch carta.
  • Porre la piastra nella vaschetta elettroforetica avendo cura che il pettine sia dalla parte del polo negativo (nero).
  • Versare il tampone TAE 1X (fino a coprire completamente il gel 275 ml ottenuti mescolando 269.5 ml (g) d'acqua distillata con 5,5 mL di TAE 50x).
  • Rimuovere delicatamente il pettine.
  • Impostare la micropipetta BIORAD 2-20 microlitri sul valore desiderato in microlitri da prelevare, ruotando la ghiera superiore. Pipettare nei pozzetti (*) come segue (inserire la punta nel pozzetto fino in fondo, scaricare la quantità, ritirare la punta e solo dopo rilasciare il pulsante; cambiare puntale ogni volta. Conviene porre un foglio intensamente colorato sotto la vaschetta per una migliore visibilità dei pozzetti):
  1. Pozzetto 1: Marker, 10 microlitri
  2. Pozzetto 2: CS, 20 microlitri
  3. Pozzetto 3: S1, 20 microlitri
  4. Pozzetto 4: S2, 20 microlitri
  5. Pozzetto 5: S3, 20 microlitri
  6. Pozzetto 6: S4, 20 microlitri
  7. Pozzetto 7: S5, 20 microlitri
  • Chiudere le camere elettroforetiche e attivare l'alimentatore: impostare il voltaggio a 100 Ve (l'amperaggio è automatico) il tempo a 45 minuti.
  • Verificare che passi corrente (bollicine sugli elettrodi).
  • Al termine della corsa scollegare l'alimentatore, prelevare con attenzione i gel e deporli in vaschetta (il tampone TAE elettroforetico può essere recuperato e riutilizzato alcune volte)
  • Tagliare l'angolo del gel più vicino al pozzetto contenente il Marker per poterlo orientare successivamente.
  • Coprire i gel con il colorante (Fast Blast DNA STAIN) così:
  1. per una colorazione LENTA diluire il Fast Blast DNA Stain 500X a 1X (0,5 ml Fast Blast 500X poi portare a 250 ml finali con acqua distillata) e lasciare agire sul gel 12-18 ore, eventualmente agitando ogni qualche ora;
  2. Per una colorazione VELOCE diluire Il Fast Blast DNA Stain 500X a 100X (25 ml Fast Blast 500X e portare a 125 ml finali con acqua distillata.
    1. lasciare agire sul gel per 2 minuti agitando dolcemente.
    2. Estrarre i gel e porli in un ampio contenitore: risciacquare con acqua di rubinetto corrente a 40-55°C per 10 secondi.
    3. Lasciare riposare in acqua di rubinetto a 40-55°C per 5 minuti (ripetere 2 volte)
  • (In caso di colorazione LENTA) Il giorno dopo recuperare il gel, asciugarlo e avvolgerlo in pellicola trasparente (può essere conservato in frigorifero a 4° C).

Recuperare il colorante che può essere riutilizzato fino a 7 volte.

Conclusione[modifica]

Osservare i risultati: quale DNA tra S1, S2, S3, S4 e S5 ha le bande uguali a quello del CS?